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細胞學堂 | 超全解析!神經(jīng)干細胞培養(yǎng)及誘導分化必看

更新時間:2025-02-14  |  點擊率:1453


神經(jīng)干細胞(NSCs)因具備獨-特的增殖能力與多向分化潛能,在神經(jīng)科學研究中發(fā)揮著重要作用。然而,在培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的過程中,科研人員常常會遇到培養(yǎng)要求高、分化控制難等挑戰(zhàn)。


那么,如何選擇合適的培養(yǎng)方式?不同培養(yǎng)條件對細胞狀態(tài)有何影響?本文將深入介紹和解析神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法、誘導分化策略,并為您解答常見實驗難題,助力您的研究更進一步!





01

神經(jīng)干細胞的基本介紹

神經(jīng)干細胞可以從不同的組織中分離獲得,常見的來源有胚胎、大腦皮層、海馬體和脊髓等。為了在體外成功培養(yǎng)神經(jīng)干細胞,合適的培養(yǎng)體系至關重要,培養(yǎng)基的成分、添加劑的使用、培養(yǎng)條件等因素都對神經(jīng)干細胞的增殖、存活以及分化狀態(tài)有著深遠的影響。

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生長培養(yǎng)基

常用配方:DMEM/F12 + B-27(不含維生素A)+ bFGF + EGF + 雙抗

為更好地滿足神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)需求,普諾賽®提供經(jīng)過配方優(yōu)化的神經(jīng)干細胞完-全培養(yǎng)基,助力您的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)工作更加高效、穩(wěn)定。

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培養(yǎng)條件

氣相:空氣,95%;CO2,5%

溫度:37℃





02

神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法

神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法主要分為懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩大類,這兩種方法各具特色,適用于不同的研究需求。

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懸浮培養(yǎng)

通過使用未經(jīng)TC(Tissue Culture)處理、未包被或低吸附的培養(yǎng)器皿和無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng),自然形成神經(jīng)干細胞球。

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貼壁培養(yǎng)

通過將神經(jīng)干細胞球消化分散成單個細胞后,接種在經(jīng)TC處理和包被的培養(yǎng)器皿內(nèi),用無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng),形成貼壁生長的單層細胞。


懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)優(yōu)缺點


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懸浮培養(yǎng)

優(yōu)點

缺點

可以形成穩(wěn)定的神經(jīng)球,保持未分化狀態(tài),有利于長期培養(yǎng)和大規(guī)模擴增

易形成大細胞球,中心細胞易缺氧、缺營養(yǎng)死亡

懸浮培養(yǎng)早期增殖速率優(yōu)于貼壁培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)自噬體形成增多,可能因為神經(jīng)球內(nèi)細胞營養(yǎng)缺乏而激活自噬

培養(yǎng)條件和方法簡單,分離培養(yǎng)成功率高,離心或半量換液操作簡單

需要頻繁離心和重懸細胞,增加細胞損失

干性維持能力更強,相比貼壁培養(yǎng)不易分化

不利于誘導分化和分化形態(tài)觀察

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貼壁培養(yǎng)

優(yōu)點

缺點

能形成形態(tài)規(guī)則的單層細胞,傳代損耗低,容易觀察到細胞形態(tài)和分化階段,更有助于神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)和存儲

長期培養(yǎng)易自發(fā)分化

貼壁培養(yǎng)的單層NSCs,與培養(yǎng)基接觸面更大,誘導分化成功率更高

貼壁培養(yǎng)的NSCs經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后仍可保持較強的增殖能力,同時具有多分化潛能的特性

NSCs貼壁不牢,易脫落,需使用TC處理和包被的培養(yǎng)器皿;細胞傳代操作復雜,傳代后易再次懸浮成球

貼壁培養(yǎng)的NSCs自噬水平較低,有利于維持細胞的穩(wěn)定性和增殖能力







03

神經(jīng)干細胞的誘導分化

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1)誘導分化為星形膠質細胞

將神經(jīng)干細胞球體消化分散后離心,使用星形膠質細胞誘導培養(yǎng)基(DMEM高糖+B-27,含維生素A+N-2+GlutaMAX+FBS+bFGF[1])重懸細胞,鋪入多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。隨著誘導分化的進行,神經(jīng)干細胞逐漸轉變?yōu)樾切文z質細胞,其形態(tài)變化如圖1所示。

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圖1. 神經(jīng)干細胞誘導分化為星形膠質細胞的形態(tài)變化

2)誘導分化為少突膠質細胞

與星形膠質細胞誘導方法類似,使用少突膠質細胞誘導培養(yǎng)基(DMEM/F12+B-27,含維生素A+EGF+bFGF+T3+胰島素[2])誘導神經(jīng)干細胞分化為少突膠質細胞,其形態(tài)變化如圖2所示。

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圖2. 神經(jīng)干細胞誘導分化為少突膠質細胞的形態(tài)變化

3)誘導分化為神經(jīng)元細胞

將神經(jīng)干細胞球體消化分散后離心,使用神經(jīng)元細胞誘導培養(yǎng)基(Neurobasal神經(jīng)元培養(yǎng)基+1% N-2+2% B-27含維生素A+NEAA+β巰基乙醇+L-谷氨酰胺)重懸細胞,鋪入多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后,在神經(jīng)元細胞誘導培養(yǎng)基中加入10 ng/mL GDNF和10 ng/mL BDNF,以進一步促進神經(jīng)元的分化[3]。






04

神經(jīng)干細胞培養(yǎng)常見問題解答

1)

如何準確判斷神經(jīng)干細胞的傳代時機?

神經(jīng)干細胞傳代時機需根據(jù)神經(jīng)干細胞球的大小和形態(tài)判斷。應讓神經(jīng)干細胞球中間保持明亮,避免細胞球生長過大。如圖3所示,右下角神經(jīng)干細胞球體過大,球中部發(fā)暗,應該在這種狀態(tài)出現(xiàn)之前進行傳代。一般而言,神經(jīng)干細胞進行1:2傳代后,大約2-3天可再次傳代。

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圖3. 神經(jīng)干細胞球生長形態(tài)

2)

神經(jīng)干細胞較難消化成單個細胞,是否必須完-全消化?

在懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細胞時,無需將神經(jīng)干細胞球徹-底消化至單個細胞狀態(tài)。而貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細胞時,需將其消化分散成單個細胞,這樣更利于細胞的貼壁生長(如圖4)。在此過程中,推薦使用Accutase酶,相較于常用的胰酶,Accutase酶消化作用更為溫和,能夠顯著降低對細胞的損傷風險。

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圖4. 使用Accutase酶消化成單細胞接種圖

3)

懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細胞,如何進行換液?

建議采用半量換液法進行操作,具體操作步驟如下:將培養(yǎng)瓶豎直靜置,待大部分細胞自然沉降后,吸棄原培養(yǎng)體積一半的細胞培養(yǎng)上清液,補加等體積新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。為減少細胞損失,可將培養(yǎng)上清轉移至離心管中,使用離心機500 rpm離心5 min后,棄去上清,用等體積新鮮培養(yǎng)基重懸細胞,放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。





無論是懸浮培養(yǎng)還是貼壁培養(yǎng),都各有優(yōu)缺點,科研人員可根據(jù)實驗需求選擇合適的方法。此外,掌握正確的誘導分化策略和優(yōu)化培養(yǎng)條件,能夠有效提升神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)成功率。

希望本篇指南能為您的實驗提供實用參考,如有更多疑問,歡迎留言交流!更多細胞培養(yǎng)干貨,請持續(xù)關注細胞學堂專欄~




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參考文獻

[1] 

Sardar D, Lozzi B, Woo J, et al. Mapping Astrocyte Transcriptional Signatures in Response to Neuroactive Compounds[J]. International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(8):3975.

[2]

楊慧敏. 新生大鼠神經(jīng)干細胞定向分化為少突膠質細胞的實驗研究[D]. 重慶醫(yī)科大學, 2006. 

[3]

李登賀. 神經(jīng)干細胞定向分化為中間神經(jīng)元的研究[D]. 昆明理工大學, 2016.




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