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細胞凍存與復蘇的技術(shù)原理和操作步驟

更新時間:2022-02-18  |  點擊率:3732

細胞凍存與細胞復蘇,是細胞培養(yǎng)過程中的常見工作。


細胞凍存,是指將細胞貯存在超低溫環(huán)境中,使細胞暫時“冬眠"的技術(shù),在需要的時候再進行復蘇。


細胞復蘇,是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細胞快速解凍,并使細胞重新恢復生長的技術(shù)。


本文將為大家介紹細胞凍存與復蘇的技術(shù)要點和操作步驟。 


細胞凍存篇


凍存原則


細胞凍存原則為“慢凍",即讓細胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。


如果直接將細胞懸液放在超低溫下快速冷凍,細胞會受到冷凍損傷而死亡。在凍存液中添加的保護劑(如DMSO、甘油)和在凍存盒中添加的異丙醇,都起到程序性降溫的作用。


DMSO使用注意事項


DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中,延緩溫度下降速度,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而起到保護細胞的作用。


需注意的是,DMSO溶于培養(yǎng)基時,將釋放大量熱量,所以細胞凍存液需提前配制,不能直接將DMSO加入含有細胞的培養(yǎng)基中,避免燙傷細胞。


另外,DMSO屬于致癌物質(zhì),使用時應戴好手套,規(guī)范操作。


程序凍存液配方


程序凍存液成分一般由基礎培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO組成。血清比例為10%~90%,DMSO比例為5%~10%。根據(jù)普諾賽實驗室細胞培養(yǎng)經(jīng)驗,推薦凍存液配比:55%基礎培養(yǎng)基+40%胎牛血清+5%DMSO,難養(yǎng)細胞可用90%胎牛血清+10%DMSO凍存。


細胞凍存密度


細胞凍存和復蘇過程中,不可避免會損失部分細胞,所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助于提升細胞復蘇存活率,推薦密度為100~300萬細胞/mL。


凍存操作方法


方法一:使用程序凍存盒 



使用程序降溫盒是最-常用的凍存方法。市面上的降溫盒有些需要添加異丙醇,有些則不需要。


降溫盒須恢復室溫后再使用。


根據(jù)普諾賽實驗室細胞培養(yǎng)經(jīng)驗,使用程序凍存盒凍存效果良好,沒有凍存盒的同學可以參照下文方法二和方法三。


操作步驟

步驟1:配制程序凍存液,放在室溫備用或放在4℃預冷

步驟2:離心收集對數(shù)生長期的細胞(貼壁細胞消化下來離心,懸浮細胞直接離心,轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,時間3min)

步驟3:用配制好的凍存液重懸細胞,按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,擰緊管蓋,做好標記

步驟4:凍存管放入凍存盒,凍存盒放入-80℃冰箱過夜(24h)

步驟5:凍存管從凍存盒取出,轉(zhuǎn)移至液氮長期保存


使用凍存盒操作示意圖

 ▲ 使用凍存盒操作示意圖


方法二:使用無血清非程序凍存液 



無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液,無需自己配制,無需降溫盒,大大提升了便捷性。


但是,并非所有細胞都適用于這種凍存液,使用前必須做凍存測試,沒問題后再批量應用。


操作步驟

步驟1:從冰箱拿出無血清非程序凍存液,待用

步驟2:離心收集對數(shù)生長期的細胞(貼壁細胞消化下來離心,懸浮細胞直接離心,轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,時間3min)

步驟3:棄上清,加入適量無血清非程序凍存液,重懸細胞

步驟4:按照1~1.5mL/管的量分裝到凍存管中,擰緊管蓋,做好標記

步驟5:將凍存管直接移入-80℃冰箱中,24h后轉(zhuǎn)移至液氮長期保存


使用無血清非程序凍存液操作示意圖

▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖


方法三:手動梯度降溫 



在沒有凍存盒或者非程序凍存液時,可以選擇手動梯度降溫。但手動梯度降溫不適用于所有細胞,且效果不穩(wěn)定,同樣需要先做凍存測試。


操作步驟

步驟1:配制程序凍存液,放在室溫備用或放在4℃預冷

步驟2:離心收集對數(shù)生長期的細胞(貼壁細胞消化下來離心,懸浮細胞直接離心,轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,時間3min)

步驟3:用配制好的凍存液重懸細胞,按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,擰緊管蓋,做好標記

步驟4:凍存管按照【4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(24h)→液氮】的順序放置


手動梯度降溫操作示意圖

▲ 手動梯度降溫操作示意圖


細胞復蘇篇


細胞復蘇講究“快融",越快融化,細胞所受損傷就越小。細胞復蘇的操作不復雜,但每一步都必須穩(wěn)扎穩(wěn)打,才能最大限度地提高復蘇存活率。


細胞復蘇步驟


步驟1:水浴鍋預熱至37℃?zhèn)溆?/strong>


步驟2:準備15mL離心管,并向其中加入適量培養(yǎng)基待用

小貼士:離心管中加入2~9mL的培養(yǎng)基,比較難養(yǎng)的細胞,可適量增加培養(yǎng)基。


步驟3:將細胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出,放入PE手套中,迅速投入水浴鍋

小貼士:如果冰箱或液氮距離水浴鍋路途較遠(步行超過1min),要把細胞先置于干冰上,再送至水浴鍋。如果將細胞凍存管直接放在手上或口袋里,可能導致溫度逐漸回升而產(chǎn)生冰晶損傷細胞。而將細胞凍存管裝在PE手套中,是為了預防污染。


步驟4:用力搖晃凍存管,使其在1分鐘內(nèi)融化

小貼士:這一步越快融化越好,最好能放計時器在旁邊。如果1分鐘內(nèi)沒有融化,可能是凍存液量偏多,或者搖晃力度不夠。


步驟5:用紙巾擦拭水漬,轉(zhuǎn)移至生物安全柜。用移液槍吸取細胞懸液,緩慢滴加到步驟2中準備好的離心管


小貼士:當同時復蘇多管細胞時,注意不要弄混。


步驟6:1200rpm離心3分鐘

小貼士:離心是為了去除DMSO,對于DMSO敏感的細胞,必須離心;若復蘇的細胞對DMSO不敏感,步驟6、步驟7可以省略,直接將培養(yǎng)基補足至10mL,接種至培養(yǎng)器皿中,第二天換液。


步驟7:棄上清,用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞,接種至新的無菌培養(yǎng)器皿中

細胞復蘇操作示意圖

▲ 細胞復蘇操作示意圖


做完步驟7,細胞就復蘇好了。復蘇的細胞需要一段時間恢復狀態(tài),復蘇后的細胞密度低于80%時,48小時內(nèi)不要換液,待細胞形態(tài)、生長速度等恢復正常,再進行細胞傳代等操作。(不要因為復蘇后兩三天細胞狀態(tài)不好就丟棄,應耐心等待至少一周。)


當然,細胞復蘇后狀態(tài)很好的情況下,可以提前開始后續(xù)的細胞培養(yǎng)實驗。


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